Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır? - DERS KİTABI CEVAPLARI

Yeni Yayınlar

Eylül 07, 2018

Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır?

Edit
 DERS KİTABI CEVAPLARINA BURADAN ULAŞABİLİRSİNİZ! 

Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır? 

Çok sayıda tıbbi uygulama ve bilimsel çalışmalar için kan ya da başka örneklerde karışık halde bulunan hücre grubundan belirli bir hücre türünü ayırt etmeye ve incelemeye ihtiyaç duyulur. Örneğin; hastalık tanısı için kandan sadece lenfosit isimli kan hücrelerinin ayrıştırılıp incelenmesi gerekebilir. Bu işlemi yapabilmek için akım sitometrisi adlı bir cihaz kullanılır.


Tarihsel olarak, geliştirilen ilk akım sitometrisi hücrelerin boyutunu tespit edebiliyordu. Günümüzde ise bu cihazlar oldukça gelişmiştir ve 14 parametreyi eş zamanlı olarak tespit etme kapasitesine sahiptirler. Akım sitometrisi; tek bir hücrenin ya da mikroorganizmalar, nükleus, kromozomlar gibi diğer partiküllerin ışık kaynağının önünden geçerken optik ve ışınım özelliklerini tespit edebilir. Böylece, hücreleri analiz etmek ve birbirinden ayırmak için boyut, antikor ya da boyalardan kaynaklı ışınım özellikleri gibi parametreler kullanılır. Akım sitometrisinin altında yatan prensip; ışığın saçılması ile ve ışığın kaynaktan çıktıktan sonra hareketli bir parçacığa çarptıktan sonra ortaya çıkan ışık olan ışınım emisyonu ile ilişkilidir. Elde edilen veri, parçacıkların biyokimyasal, biyofiziksel ve moleküler yönleriyle ilgili önemli bilgiler verebilir. Floresan proptan türevli ışınım emisyonu, hücre ve hücresel bileşenlere bağlanabilen floresan probun miktarı ile orantılı iken, ışığın saçılması hücrenin yapısal ve morfolojik özellikleriyle ilişkilidir.

Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır?
Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır? 

Ayırıcı olan ve ayırıcı olmayan olmak üzere iki tür akım sitometrisi vardır. Ayırıcı tipi partikülleri ayırabilirken, ayırıcı olamyan tipi ışık saçılımı ve ışınım emisyon özelliklerine sahiptir. Floresan ile aktive olan hücre ayırıcılar (FACS), karışık bir hücre popülasyonundan floresan işaretli hücreleri ayırabilen akım sitometrileridir.

Akım sitometrisi ve hücre ayırıcıların ana bileşenleri; akışkanlar, optikler, elektronik ağ (detektörler) ve bilgisayardır. Akışkanlar; partikül içeren sıvının, odaklanmış ışık kaynağına yönelmesinden sorumludur. Collection optikler, partiküldeki ışık saçılımını ya da floresan ışığı elektronik bir ağa iletirken, excitation optik hücrelerde ya da partiküllerde ışık kaynağına odaklanır. Elektronik ağ, sinyali tanımlar ve sinyali dijital veriye dönüştürür. Dijital veri ışık yoğunluğuyla orantılıdır ve bilgisayar da veriyi analiz etmek için gereklidir.

Akım sitometrisi; hücre zarında, sitoplazmada ve nükleusta bulunan proteinleri tanımlamaya dayalı çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Ek olarak, tüm hücre ve organeller, nükleus, DNA, RNA, kromozomlar, sitokinler, hormonlar gibi hücresel bileşenler ve protein içeriği akım sitometrisi tarafından tespit edilebilir. Hücre çoğalması ve hücre döngüsünün analizi, kalsiyum akışının ve zar potansiyelinin ölçülmesi, akım sitometrisi için geliştirilmiş yöntemlerin en yaygın kullanılan örnekleridir.

Akım Sitometrisinin Bileşenleri

Akışkan Sistem

Akışkan sistemi, hücreleri solüsyondan enstrümana, ortam sıvısı ve basınçlı bölge hakkında veri elde etmek için aktarır. Ortam sıvısı (genellikle PBS) seyreltici bir sıvıdır. Bu sıvı basınçlı bölgenin merkezinde flow chamber’a enjekte edilir. Ayrıca basınçlı hava süspansiyon halindeki hücreleri örnek tüpünden flow chambera enjekte eder. Hücrelerin enjeksiyon oranı analiz amacıyla manipüle edilebilir. Örneğin; yüksek akım oranı memeli hücrelerinin profilini çıkartmak gibi kalitatif ölçümler için kullanılır. Düşük akım oranı ise DNA içerik analizi için uygundur. Analizin doğru şekilde yapılabilmesi için akışkan sistemin hava kabarcığı içermemesi gerekiyor.



Optik Sistem

Akım sitometrisi; sabit pozisyonda collection optiği, laser ve lensleri içeren ışık saçılımını tutan bir optik sisteme sahiptir. Lensler lazer ışığını odaklamak için kullanılır. Lazer hücreye çarptıktan sonra, hücrenin kenarlarından saçılır ve buna ışığın saçılması denir. Forward saçılma (FCS) ve side saçılma (SSC) olmak üzere iki tür saçılma vardır. Toplam ışık saçılmasını etkileyen faktörler; membran, nükleus, hücrenin granüllüğü, hücrenin şekli ve yüzey özellikleridir. Genel olarak, hücrenin şekli ve hücrenin iç yapısının kompleksliği saçılmanın tipini belirler. FCS, hücrenin büyüklüğünü belirler. SSC ise hücreden yansıyan ışıktır ve hücrenin iç yapısının kompleksliği ile orantılıdır. Heterojen bir hücre popülasyonu içerisinde hücre tiplerinin ayırtedilebilmesi için FCS ve SSC ölçümlerinin birlikte kullanılması gerekir.

Akım sitometrisinde, florokromların türüne göre çeşitli lazer konfigürasyonları vardır. FITC gibi sentetik boyaları ve alglerden elde edilen doğal boyaları uyarmak için en yaygın olarak argon lazer kullanılır.

Collection optics kısmı ise ışığı toplar ve doğrudan detektöre aktarır. Uygun bir filtre ile, floresan boyanın özelliği detektör tarafından tanımlanabilir. Elde edilen veriler, bilgisayarda grafik olarak görüntülenebilir.

Elektrostatik Hücre Ayırma

Akım sitometrisinde önceden tanımlanmış özelliklere göre hücreler yakalanır ve ayırılır. İlgilenilen hücre türü toplandığında; mikroskobik, biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar gibi ileri analizler için kullanılabilir. Hücre ayırmak için ise; tek bir parametre ya da birkaç parametrenin kombinasyonundan yararlanılabilir. Hücre ayırmanın genel prensibi; hücre içeren yüklü taneciklerin elektrostatik sapmasına dayanır. Bu yöntemde, akışkan içerisindeki damlalar lazer kaynağının önünden geçerken elektrotlar tarafından yüklenir. Damlalar, yüklerine göre ana akımdan saparlar. Pozitif yüklü damlalar negatif yüklü platin kısıma, negatif yüklü damlalar ise pozitif yüklü platin kısıma doğru saparlar. Yüksüz damlalar da atık kısmında toplanır.

FACS; karışık bir hücre popülasyonundan belirli bir veya daha fazla floresan işaretli hücre türünü ayırabilen akım sitometrisi türüdür. Akışkan lazer kaynağının önünden geçerken; floresan işaretli seçilmek istenen hücreleri bilgisayar yardımıyla ayırır. Damladaki floresan işaretli hücreler yüklenir, yüklenen hücre tipleri farklı bölmelere ayrılır.

Işınımın Prensibi

Bir floresan bileşim; ışık enerjisini absorblayan spesifik dalga boylarına sahiptir. Işığın absorblanması, bir elektronun temel durumdan yüksek enerji seviyesine geçmesine neden olur. Uyarılmış elektron hızlı bir şekilde temel hale geri döner ve bu sırada fazla enerjiyi ışık fotonu olarak salar. Bu enerji geçişine floresan adı verilir. Akım sitometrisi de hücreleri tespit etmek için floresan özelliğinden yararlanır.

Florokrom ve Özellikleri

Hücrelerdeki floresan bileşenlerin sayısı sınırlıdır. Bu nedenle hücreler, florokrom adı verilen floresan problarlarla işaretlenir. Floresan problar; farklı hücre popülasyonları, hücre reseptörlerinin ve organellerinin tanımlanması, hücre ayırma, immünofenotipleme, nükleik asit içeriğinin belirlenmesi, enzim aktivitesinin ölçülmesi ve apoptotik hücre popülasyonunun belirlenmesi gibi çok sayıda uygulama için kullanılır.

Akım sitometrisinde kullanılan florokromlar; proteinleri etiketlemek için kullanılan florokromlar, nükleik asitler için olan florokromlar ve reporter moleküller olmak üzere birkaç gruba ayrılırlar. Uygun florokromun seçilmesi önemlidir ve bu seçim kullanılacak lazere bağlıdır. Örneğin; argon-iyon lazeri kullanılacaksa, ilk seçenek FITCH florokromudur.

Veri Analizi

Akım sitometrisi data analizi, biyolojik deneyler için en kritik parametre olarak değerlendirilir. Veri analizinin en önemli prensibi, araştırılan hücre tipinin ve özelliğinin görüntülenmesidir. Bilgisayarda görüntülenen grafikte birkaç bölge tanımlanabilir. Bu parametreler, ölü hücreler gibi istenmeyen partiküllerden kaynaklı sonuçların elenebilmesine olanak tanır. Beyaz kan hücrelerinin farklı özellikleri, granülositler, monositler ve lenfositler bu yolla birbirlerinden ayırt edilebilir. Araştırmacı, sadece lenfositleri içerecek şekilde analiz yapmak istediğinde FSC ya da hücre büyüklüğünü temel alarak, FSC SSC’ye karşı kullanılarak lenfositler analiz edilebilir. Elde edilen sonuç, sadece lenfositlerin floresan özelliklerini gösterir. Bu sayede istenilen hücre tipi diğer hücrelerden ayrılmış olur. Ayrılan hücreler de mutasyon analizi gibi başka analizler için kullanılabilir.

Hiç yorum yok:

Yorum Gönder